步骤

周期

交付材料

1.构建噬菌体抗体库

1.利用免疫的cDNA，扩增出scFv基因片段，构建M13单链丝状噬菌体展示抗体免疫文库。

2.抗体库质量：

（1）scFv抗体片段有效插入率﹥99%

（2）抗体库容量达到109次方

3.从文库中随机挑取96个克隆，对其中30个克隆测序，分析scFv抗体片段的多样性和正确率，保证正确率≥80%，另外提供30个克隆用于测序验证。

4-6周

提供质检报告与抗体库

①完整的项目报告和原始数据，报告需包含实验流程、分析评估实验的主要操作步骤、以及详细的实验结果；

②共30个文库随机克隆的甘油菌和测序引物；

③噬菌体展示抗体免疫文库的Kit（包含文库甘油菌1ml × 10支和文库噬菌粒质粒10 μg）；

2.抗体库筛选

1.筛选方案确定：根据项目实际情况，选择不同的筛选方案，如竞争筛选，固相筛选，液相筛选，细胞筛选，负筛选等筛选方法。

2.淘选： 对抗原蛋白进行SDS-PAGE分析验证，并进行生物素标记；针对生物素化靶点蛋白，利用链霉亲和素预包被的ELISA Plates，淘筛免疫文库；抗原施压法进行2-3轮淘筛，确定充分富集且靶点筛选组的滴度要远高于对照筛选组。

3.结合筛选：选择从Output克隆中，分别挑取单克隆进行阳性克隆鉴定。经培养和Phage Rescue后，进行Monoclonal Phage ELISA检测。

4.测序分析:鉴定出抗原结合强阳性的scFv抗体克隆，测序分析，比对序列制作进化树，选择序列独特的克隆。

5.表达验证：少量表达阳性scFv克隆，利用Soluble ELISA检测对靶点抗原的特异性结合能力。

4-6周

5个以上的特异性克隆

3.抗体表达纯化

将抗体基因克隆至真核表达载体。

3-4周

高纯度抗体100-500μg

4.亲和力测定

采用Biacore 测定抗体的亲和力

采用Nicoya LSPR 测定抗体的亲和力

采用Fortebio octet 测定抗体的亲和力

1周

1周

1周

亲和力测定数据

5.抗体人源化

1.识别FR、CDR、关键残基、PTMs。

2.通过同源比对，考虑可变区一致性及相似性、关键残基、PTMs、稳定性等因素，选择更好的人源抗体Germline FR作为模板，与CDR 重组，设计初始人源化抗体。

3.分析抗体序列和结构，确定需要回复突变的关键残基，设计不同数量的回复突变VH。

4.将人源化基因克隆至真核表达载体，转染293瞬时表达获得100-500μg 纯化抗体。

5.结合活性及亲和力检测。

6-8周

至少一个人源化抗体（亲和力、表达量与原抗体相当）